蜂胶降糖作用机理的研究

2020年12月31日15:10:39蜂胶降糖作用机理的研究已关闭评论 295

糖尿病是一种以空腹血糖及糖化血红蛋白异常升高为主要表现的慢性代谢性疾病。多项研究证实,肠黏膜屏障损伤与糖尿病的发生发展密切相关。因此,修复肠黏膜损伤可望作为新的作用靶点用于糖尿病防治,而针对肠黏膜屏障检测方法的选择,则成为降糖药物改善肠黏膜屏障及其机制研究不可或缺的重要环节。蜂胶降糖作用机理的研究

目前,肠黏膜屏障检测方法主要包括肠上皮细胞连接装置超微结构观察、紧密连接相关蛋白表达水平检测及肠道屏障功能血清学指标检测等,但其反映肠黏膜损伤及疗效评价的灵敏性却不尽相同。蜂胶是一种富含黄酮、萜烯等多种生物活性成分的天然产物,动物实验和人群研究均表明,蜂胶具有降血糖作用,但尚不清楚蜂胶的降糖作用是否与其对肠黏膜损伤的修复作用有关。本研究旨在以糖尿病大鼠为研究对象,对上述各种肠黏膜屏障功能检测方法进行分析评价,为蜂胶降糖的肠黏膜损伤修复机制研究提供灵敏可靠的实验手段。

目的

对糖尿病大鼠肠黏膜屏障功能检测方法进行分析评价,并以此为靶点探讨蜂胶是否通过修复肠黏膜屏障发挥降血糖作用。

方法

建立糖尿病大鼠模型,以80及160mg/kg蜂胶进行干预,持续4周。罗氏血糖仪检测尾血血糖(FBG);高效液相色谱法检测红细胞糖化血红蛋白(HbA1c)含量;ELISA实验检测血浆D-乳酸(D-LA)及连蛋白(zonulin)含量;透射电镜观察肠组织上皮细胞间连接装置超微结构变化,WesternBlotting检测其紧密连接相关蛋白表达水平。

结果

成功建立糖尿病大鼠模型,80、160mg/kg蜂胶干预4周后,大鼠血糖值分别达到17.57mmol/L和18.24mmol/L,HbA1c含量分别达到8.94%及8.22%,均较模型组明显降低(P<0.05)。补充蜂胶后,糖尿病大鼠回肠及结肠组织上皮细胞间紧密连接、黏着连接间隙异常增宽等现象得到有效缓解。补充蜂胶使回肠和结肠组织中claudin-1、occludin及ZO-1蛋白表达水平显著升高,且具有剂量依赖性(P<0.05)。80及160mg/kg蜂胶干预后,血清D-LA含量分别为160.03ng/mL及151.18ng/mL,zonulin含量分别为650.14μg/mL及647.60μg/mL,均较模型组降低,但各组间比较,均未见显著性差异(P>0.05)。

结论

肠黏膜屏障超微结构观察及肠组织紧密连接相关蛋白表达水平检测较肠黏膜屏障功能血清学检测可能具有更高的灵敏性,可作为可靠的实验手段应用于蜂胶降糖的肠黏膜屏障修复机制研究。

本研究通过高糖高脂饮食联合STZ腹腔注射的方法成功建立了糖尿病大鼠模型,并通过蜂胶补充,有效控制了糖尿病大鼠血糖及糖化血红蛋白水平,表明蜂胶具有良好的降血糖效果,与相关报道一致。随后,本实验采用超微结构观察、Westernblotting及血清学检测三种实验方法,从不同角度对糖尿病大鼠肠黏膜屏障损伤状况进行评价和分析,以期获得敏感可靠的肠黏膜屏障功能检测方法,用于蜂胶降糖作用的肠黏膜屏障修复机制研究。

国内外多项研究显示,肠黏膜屏障完整性破坏在糖尿病的发生发展过程中发挥重要作用。Zhong等对38例2型糖尿病患者和152例非糖尿病患者进行比较发现,2型糖尿病患者小肠绒毛性水肿的发生率高达78.9%,Lewis评分也显著高于非糖尿病患者。

Horton等采用口服51Cr-EDTA的方法对20例2型糖尿病患者进行检查,发现其肠道渗透性均异常增高。Lee等的研究则显示,非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠在感染具有肠黏膜屏障破坏能力的野生型C.rodentium菌株后,不仅其肠黏膜屏障遭到破坏,同时,其胰岛炎症也呈现快速发展趋势。以上人群研究及动物实验均表明,肠黏膜屏障损伤参与了糖尿病的发生发展并发挥关键作用,它也因此成为药物降糖潜在的作用靶点。

本研究透射电镜结果发现,糖尿病大鼠回肠及结肠组织上皮细胞紧密连接及黏着连接发生间隙增宽、密度降低等不同程度异常改变,蜂胶补充有效改善了其紧密连接等细胞连接装置损伤状况,并具有一定剂量依赖性。紧密连接位于上皮细胞基底外侧膜顶端,是肠黏膜上皮细胞间最主要的连接方式,与黏着连接、桥粒、缝隙连接等共同构成细胞间连接装置,在封闭细胞间隙,维持肠黏膜屏障结构与功能完整性方面发挥决定性作用。本研究结果表明,肠黏膜细胞连接超微结构观察对于糖尿病大鼠肠黏膜屏障功能检测具有较高的灵敏性,可用于降糖药物的肠黏膜损伤修复疗效观察。

Westernblotting结果发现,糖尿病大鼠回肠和结肠组织中claudin-1、occludin及ZO-1等紧密连接相关蛋白表达水平均发生不同程度下调,补充蜂胶后,其下调状况得到有效缓解和控制,且随着蜂胶剂量的增加,改善效果尤为明显。Claudin-1和occludin是紧密连接中最主要的跨膜蛋白,也是参与肠黏膜屏障功能调节的主要功能蛋白。它们在胞外与跨膜蛋白相互作用,在胞内则通过支架蛋白ZO-1与肌动蛋白等胞内蛋白相互联系。

这种由多种跨膜蛋白及粘附分子组成的“拉链样”结构,环绕整个细胞呈带状分布,共同构成细胞间稳定的紧密连接体系。多项研究指出,紧密连接相关蛋白表达水平降低可造成紧密连接崩解断裂,导致肠黏膜屏障结构与功能损伤;上调肠黏膜紧密连接相关蛋白表达,可使肠黏膜损伤得到修复,缓解疾病进程,本研究Westernblotting与透射电镜结果相互印证,得到了较为一致的结论,表明将紧密连接相关蛋白表达水平检测用于糖尿病大鼠肠黏膜损伤状况评价亦具有较高的灵敏性,可作为药物降糖的肠黏膜屏障修复机制研究较为可靠的实验手段之一。

D-乳酸是肠道细菌代谢产物,当肠道屏障遭到破坏时,D-乳酸可通过受损黏膜渗透入血,使循环血中D-乳酸含量升高;连蛋白是紧密连接通路重要蛋白,当肠黏膜通透性升高时,连蛋白亦可释放入血,引起血液中连蛋白水平增高,二者可在一定程度上反映肠道屏障损伤状况。而本研究血清学检测结果发现,血浆D-乳酸和连蛋白水平在各组大鼠间均无显著性差别,与透射电镜及Westernblotting检测结果存在不一致性。表明作为降糖药物肠黏膜修复疗效评价手段,肠黏膜屏障超微结构观察及紧密连接相关蛋白表达水平检测的灵敏性可能更优于肠道屏障功能血清学检测。

此外,本实验针对肠黏膜屏障功能检测方法的比较分析并不全面,其他多种肠黏膜屏障功能检测方法,如血浆内毒素检测、胃肠黏膜pH值测定、酚黄酞测定及肠型脂肪酸结合蛋白含量检测等尚未被涉及,将在以后的实验中加以完善和补充。

总之,肠黏膜屏障超微结构观察及紧密连接相关蛋白表达水平检测能较好反映糖尿病大鼠肠黏膜屏障损伤状况,较血清学检测具有更高的灵敏性,可成为降糖药物肠黏膜屏障修复机制研究可靠的实验手段。同时,蜂胶降糖作用也与其调节紧密连接相关蛋白表达,修复肠黏膜损伤有关。

(糖尿病大鼠肠黏膜屏障损伤检测方法的评价及蜂胶降糖作用的探讨,中国比较医学杂志2019,29(03),30-36 DOI:10.3969/j.issn.1671-7856.2019.03.005)

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